ویرایش ژنی هدفمند در سلول‌های T پرایمری انسان با استفاده از ریبونوکلئوپروتئین‌های CRISPR/Cas9
مقدمه: ناک اوت ژنی سلول‌های T پرایمری با واسطه‌ی Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) محدودیت‌های زیادی برای کاربردهای بالینی دارد. انتقال مستقیم پروتئین نوترکیب Cas9 و Guide RNA (gRNA) سنتتیک به عنوان یک کمپلکس ریبونوکلئوپروتئ...
| Format: | Article |
|---|---|
| Language: | fas |
| Published: |
Isfahan University of Medical Sciences
2021-03-01
|
| Series: | مجله دانشکده پزشکی اصفهان |
| Subjects: | |
| Online Access: | https://jims.mui.ac.ir/article_12264_754f4f6e93dae4436a457dcbf105c64e.pdf |
| _version_ | 1797194275369254912 |
|---|---|
| collection | DOAJ |
| description | مقدمه: ناک اوت ژنی سلول‌های T پرایمری با واسطه‌ی Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) محدودیت‌های زیادی برای کاربردهای بالینی دارد. انتقال مستقیم پروتئین نوترکیب Cas9 و Guide RNA (gRNA) سنتتیک به عنوان یک کمپلکس ریبونوکلئوپروتئینی از پیش مونتاژ شده (Ribonucleoprotein یا RNP) به یک روش قدرتمند برای ویرایش ژنی بسیار کارآمد در سلول‌های T پرایمری تبدیل شده است. در این مطالعه، از سیستم انتقال مبتنی بر Cas9 RNP برای ناک‌اوت هدفمند ژن‌های T Cell receptor alpha constant (TRAC) و β2 microglobulin (B2M) در سلول‌های T پرایمری انسانی استفاده گردید.
روش‌ها: بدین منظور gRNAهای اختصاصی برای هدف قرار دادن اگزون‌های ابتدایی ژن‌های TRAC و B2M طراحی شدند. پروتئین Cas9 و gRNAهای سنتتیک مربوطه به طور جداگانه ترکیب شدند و به سلول‌های T پرایمری انسانی جدا شده از سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (Peripheral blood mononuclear cell یا PBMC) الکتروپوریت شدند. کارایی ویرایش ژنی با روش تجزیه و تحلیل Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) و فلوسایتومتری اندازه‌گیری شد.
یافته‌ها: سه روز پس از الکتروپوریشن سلول‌های T پرایمری با استفاده از کمپلکس‌های RNP هدف‌گیری کننده‌ی TRAC و B2M، آنالیز TIDE کارایی ناک‌اوت 60-13 درصد را برای gRNAهای هدف‌گیری کننده‌ی TRAC و 53-21 درصد را برای gRNAهای هدف‌گیری کننده‌ی B2M مشخص کرد. آنالیز فلوسایتومتری نیز به ترتیب میزان 76 و 27 درصد سرکوب کامل بیان ژن را برای کارآمدترین gRNAهای هدف‌گیری کننده‌ی TRAC (TRAC-gRNA3) و (B2M-gRNA2) B2M تأیید کرد.
نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه، نشان می‌دهد که سیستم Cas9 RNP می‌تواند به طور کارآمدی به سلول‌های T پرایمری منتقل و منجر به ناک‌اوت هدفمند ژن گردد. شیوه‌نامه‌ی شرح داده شده در این مطالعه، راهکار ساده و بسیار کارآمدی برای به حداکثر رساندن کارایی ویرایش در سلول‌های T پرایمری فراهم می‌سازد و روند ویرایش ژن برای ایمنوتراپی‌های نسل بعدی را تسهیل می‌کند. |
| first_indexed | 2024-03-12T06:37:19Z |
| format | Article |
| id | doaj.art-adc09885a77544ed98e0e4387c3dedb5 |
| institution | Directory Open Access Journal |
| issn | 1027-7595 1735-854X |
| language | fas |
| last_indexed | 2024-04-24T05:53:41Z |
| publishDate | 2021-03-01 |
| publisher | Isfahan University of Medical Sciences |
| record_format | Article |
| series | مجله دانشکده پزشکی اصفهان |
| spelling | doaj.art-adc09885a77544ed98e0e4387c3dedb52024-04-23T09:30:13ZfasIsfahan University of Medical Sciencesمجله دانشکده پزشکی اصفهان1027-75951735-854X2021-03-0139612667510.22122/jims.v39i1.1358612264ویرایش ژنی هدفمند در سلول‌های T پرایمری انسان با استفاده از ریبونوکلئوپروتئین‌های CRISPR/Cas9مقدمه: ناک اوت ژنی سلول‌های T پرایمری با واسطه‌ی Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) محدودیت‌های زیادی برای کاربردهای بالینی دارد. انتقال مستقیم پروتئین نوترکیب Cas9 و Guide RNA (gRNA) سنتتیک به عنوان یک کمپلکس ریبونوکلئوپروتئینی از پیش مونتاژ شده (Ribonucleoprotein یا RNP) به یک روش قدرتمند برای ویرایش ژنی بسیار کارآمد در سلول‌های T پرایمری تبدیل شده است. در این مطالعه، از سیستم انتقال مبتنی بر Cas9 RNP برای ناک‌اوت هدفمند ژن‌های T Cell receptor alpha constant (TRAC) و β2 microglobulin (B2M) در سلول‌های T پرایمری انسانی استفاده گردید. روش‌ها: بدین منظور gRNAهای اختصاصی برای هدف قرار دادن اگزون‌های ابتدایی ژن‌های TRAC و B2M طراحی شدند. پروتئین Cas9 و gRNAهای سنتتیک مربوطه به طور جداگانه ترکیب شدند و به سلول‌های T پرایمری انسانی جدا شده از سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (Peripheral blood mononuclear cell یا PBMC) الکتروپوریت شدند. کارایی ویرایش ژنی با روش تجزیه و تحلیل Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) و فلوسایتومتری اندازه‌گیری شد. یافته‌ها: سه روز پس از الکتروپوریشن سلول‌های T پرایمری با استفاده از کمپلکس‌های RNP هدف‌گیری کننده‌ی TRAC و B2M، آنالیز TIDE کارایی ناک‌اوت 60-13 درصد را برای gRNAهای هدف‌گیری کننده‌ی TRAC و 53-21 درصد را برای gRNAهای هدف‌گیری کننده‌ی B2M مشخص کرد. آنالیز فلوسایتومتری نیز به ترتیب میزان 76 و 27 درصد سرکوب کامل بیان ژن را برای کارآمدترین gRNAهای هدف‌گیری کننده‌ی TRAC (TRAC-gRNA3) و (B2M-gRNA2) B2M تأیید کرد. نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه، نشان می‌دهد که سیستم Cas9 RNP می‌تواند به طور کارآمدی به سلول‌های T پرایمری منتقل و منجر به ناک‌اوت هدفمند ژن گردد. شیوه‌نامه‌ی شرح داده شده در این مطالعه، راهکار ساده و بسیار کارآمدی برای به حداکثر رساندن کارایی ویرایش در سلول‌های T پرایمری فراهم می‌سازد و روند ویرایش ژن برای ایمنوتراپی‌های نسل بعدی را تسهیل می‌کند.https://jims.mui.ac.ir/article_12264_754f4f6e93dae4436a457dcbf105c64e.pdfناک‌اوت ژنایمنوتراپیگیرنده‌ی سلول t |
| spellingShingle | ویرایش ژنی هدفمند در سلول‌های T پرایمری انسان با استفاده از ریبونوکلئوپروتئین‌های CRISPR/Cas9 مجله دانشکده پزشکی اصفهان ناک‌اوت ژن ایمنوتراپی گیرنده‌ی سلول t |
| title | ویرایش ژنی هدفمند در سلول‌های T پرایمری انسان با استفاده از ریبونوکلئوپروتئین‌های CRISPR/Cas9 |
| title_full | ویرایش ژنی هدفمند در سلول‌های T پرایمری انسان با استفاده از ریبونوکلئوپروتئین‌های CRISPR/Cas9 |
| title_fullStr | ویرایش ژنی هدفمند در سلول‌های T پرایمری انسان با استفاده از ریبونوکلئوپروتئین‌های CRISPR/Cas9 |
| title_full_unstemmed | ویرایش ژنی هدفمند در سلول‌های T پرایمری انسان با استفاده از ریبونوکلئوپروتئین‌های CRISPR/Cas9 |
| title_short | ویرایش ژنی هدفمند در سلول‌های T پرایمری انسان با استفاده از ریبونوکلئوپروتئین‌های CRISPR/Cas9 |
| title_sort | ویرایش ژنی هدفمند در سلول‌های t پرایمری انسان با استفاده از ریبونوکلئوپروتئین‌های crispr cas9 |
| topic | ناک‌اوت ژن ایمنوتراپی گیرنده‌ی سلول t |
| url | https://jims.mui.ac.ir/article_12264_754f4f6e93dae4436a457dcbf105c64e.pdf |