KLONING, SEQUENSING DAN EKSPRESI cDNA PENYANDI PROTEIN MEMBRAN TAKIZOIT Toxoplasma gondii ISOLAT LOKAL - , Wayan Tunas Artama ([Yogyakarta] : Lembaga Penelitian, 2002)
Toxoplasma merupakan penyakit parasiter yang sering diasosiasikan dengan penyakit defek kongenital dan infeksi dapat mengancam keselamatan penderita, disebabkan oleh protozoa parasit yang obligat intraseluler yaitu Toxoplasma gondii. Parasit ini dapat menginfeksi berbagai jenis mamalia dan burung. Bila parasit ini menginfeksi ibu hamil dapat mengakibatkan kematian janin intra uterin atau melahirkan bayi cacat dan apabila sampai melahirkan bayi normal tetapi secara subklinis terinfeksi, maka dalam perjalanan hidupnya dapat menimbulkan gangguan fungsi serebral atau khorioretinitis. Protein membran T. gondii adalah protein yang mempunyai fungsi biologis dan bersifat imunogenik, oleh karena itu tujuan penelitian ini ditekankan pada kloning, sequensing, ekspresi dan karakterisasi gen penyandi protein tersebut untuk pengembangan diagnosis molekuler toxoplasmosis sehingga diharapkan dapat memperbaiki cara-cara diagnosis konvensional yang berbasis uji serologik. Disamping itu dapat dimanfaatkan untuk melakukan perbandingan molekuler dari isolat RH dan isolat lokal T. gondii. Selain itu protein rekombinan yang dihasilkan sangat potensial guna pengembangan sub unit vaksin, pengendalian invasi parasit ke sel, serta dalam spektrum yang lebih luas sangat bermanfaat pada pencegahan, pengendalian dan terapi toxoplasmosis. Total ribonucleic acid dan mRNA diisolasi dari takizoit yang diperbanyak secara in vivo pada mencit strain Balb/c. Messenger RNA diisolasi dari RNA total dengan menggunakan Poly A Tract mRNA isolation system (Promega) dan sintesis cDNA menggunakan Riboclone Â® EcoRI adaptor ligation system (Promega), Selanjutnya disambangkan dengan lamda gt 11 DNA yang telah di defosforilasi. Lamda gt 11 yang telah disambung dengan cDNA selanjutnya dikemas (packaging) dan di transveksi ke Escherichia coli Y1090. Plaques rekombinan diidentifikasi dengan teknik imunobloting menggunakan monoklonal/poliklonal antibodi terhadap protein membran T. gondii. Hasil transveksi dari lamda rekombinan pada E.coli Y1090 didapatkan 7 plaques yang secara imunoskrining menunjukkan adnya ekspresi protein membran T. gondii. Disamping itu hasil kloning cDNA pada plasmid ekspresi (pMal p2) di peroleh sebanyak 5 koloni yang membawa DNA insert dan mengekspresikan protein rekombinan.