| Summary: | Penyakit Jembrana merupakan penyakit akut pada sapi Bos javanicus yang mengakibatkan angka kematian tinggi. Penyakit ini disebabkan oleh suatu Lentivirus, dinamakan virus penyakit Jembrana atau Jembrana disease virus (JDV). Penyakit Jembrana sudah menyebar di berbagai kawasan di Indonesia dan juga di Australia.
Vaksinasi merupakan satu-satunya jalan untuk mencegah penyebaran penyakit Jembrana. Sepengetahuan kami, vaksin yang effisien belum didapatkan. Tujuan pekerjaan penelitian kami ialah pembuatan vaksin dengan metodologi baru yang didasarkan pada teknik Rekayasa Genetika. Dua jenis vaksin akan kami buat : vaksin protein rekombinan dan vaksin DNA, didasarkan pada protein Jembrana GAG-CA dan gen ENV-TM.
Protein subunit CA dari GAG dan protein subunit TM dari ENV merupakan antigen immunogenik penting dari antibodi pokok yang diproduksi oleh binatang terinfeksi yang terlihat pada kedua protein tersebut. Hasil yang diperoleh pada tahun pertama (2001-2002) isolasi yirus dari jaringan limpa, isolasi RNA total dari jaringan, isolasi RNA dari virus, isolasi-amplifikasi gen GAG-CA dan gen ENV-TM dengan RT-PCR, kloning di plasmid pCR-2.1, preparasi plasmid rekombinan positip, isolasi-pemotongan dan purifikasi gen GAG-CA dan gen ENV-TM dari plasmid rekombinan, preparasi vektor ekspresi prokariot pGEX-2T, kloning gen GAGCA dan ENV-TM dalam pGEX-2T, analisa klon.
Metode penelitian dan hasil tahun kedua (2002-2003) meliputi : Kontruksi vaksin DNA, pcDNA-CA dan pcDNA-TM ( isolasi gen, preparasi vektor, kloning dan analisa), double-sequencing gen gag-ca dan env-tm baik dalam konstruksi dalam vektor ekspresi prokariot pGEX..2T maupun dalam vektor ekspresi eukariot pcDNA 3.1(+), perbandingan sekwen dan uji pendahuluan pilot ekspresi protein GAG-CA dari konkstruksi pGEX-CA dan pGEX-TM dalam E. coli DH5a. dan E. coli BL 21.
Hasil yang diperoleh :
1). Isolasi gen gag-ca dan env-tm dan preparasi vektor pcDNA 3.1(+). Gen diisolasi dari konstruksi sebelumnya yang didasarkan pada plasmid pCR 2.1, yaitu pCR-CA untuk gen gag-ca dan pCR-TM untuk gen env-tm. Gen gag-ca dikeluarkan dengan digesti BamBI dan EcoRI. Gen env-tm dikeluarkan dengan digesti dengan BamHI. Fragmen DNA yang diperoleh dengan panjang 0.7 kb (gag-ca) dan 1.1 kb (env-tm) dipurifikasi dengan elektrophoresis den gel agarose, kemudian dielusi. Vektor ekspresi eukariot pcDNA 3.1 (+) dipotong dengan BamBI - EcoRI atau BamBI. Pemotongan dengan BamBI diikti dengan treatment dengan phosphatase alkali. Vektor dipurifikasi seperti di atas, 2). Konstruksi pada plasmid merupakan tahap kritis. Konsepsi konstruksi dari pemotongan plasmid harus dilaksanakan dengan tepat untuk mencegah kegagalan ekspresi dalam sel eukariot. Gen gag-ca dan gen env-tm masing-masing disisipkan dalam site BamBI - EcoRI dan BamBI vektor ekspresi eukariot pcDNA 3.1 (+). Penyisipan dalam dua site berbeda dan dalam site tunggal yang sudah ditreatmen dengan phosphatase alkali mempertinggi effisiensi kloning, dengan mencegah adanya self-ligasi vektor.
Dari hasil tranfeksi dalam E. coli DH5a. dengan 25 ng vektor didapatkan 1500-2000 klone bakteri resisten terhadap ampicilline. Beberapa klone dikultur dan plasmid dianalisa dengan BamBI - EcoRI (konstruksi gag-ca dinamakan pcDNA-CA dan dengan BamBI (konstruksi env-tm dinamakan pcDNA-T-M). Hasil analisa menunjukkan bahwa ke tujuh klon konstruksi pcDNA-CA yang dianalisa semuanya positip mengandung sisipan gen gagca. Effisiensi kloning dengan demikian adalah 100%. Berkat konsepsi primer dan konstruksi, ke 7 klon tersebut memiliki gen dalam orientasi sens sehingga gen akan ditranskripsi menjadi mRNA dan protein disintesiskan. Analisa klon konstruksi pcDNATM menunjukkan bahwa dari 8 klon yang dianalisa, 7 adalah klon positip yang menyandu gen env-tm. Maka effisiensi klonoing mencapai sekitar 85%. Namun penyisipan gen terlaksana dalam orientasi sens atau anti-sens. Penentuan lebih lanjut orientasi gen dilakukan dengan digesti dengan EcoRI dan EcoRV. Digesti tersebut mampu membedakan pola restriksi orientasi sens atau anti-sens. Hasil analisa menunjukkan bahwa dari 7 klon posotip, 6 memiliki gen dalam orientasi anti-sens dan satu klon memiliki gen dalam orientasi sens. Klon ini akan dipergunakan sebagai calon vaksin DNA.
1) Double-sequencing gen gag-ca dan env-tm dalam konstruksi pGEX-2T dan pcDNA3.1 (+), Hasil doublesequencing (dari kedua ujung) menunjukkan dengan jelas bahwa : a) penyisipan gen dalam vektor ekspresi prokariot pGEX-2T maupun dalam vektor ekspresi eukariot pcDNA3.1 (+) terlaksana sesuai dengan konsepsi, b) tidak ada perubahan reading frame. c) sequence sesuai dengan sequence gen gags-ca dan env-tm. Sequencing ini juga menunjukkan adanya 3 point mutation pada gen gag-ca dan satu point mutaiton pada gen env-tm. Ke-empat mutasi tersebut adalah mutasi pada nukleotida ketiga dari kodon dan asam amino yang dikodekan tidak berubah. Strain virus jembrana yang kami pergunakan berbeda dengan strain reference sequence, baik tempat maupun tahun pengambilannya. Hasil menunjukkan adanya evolusi genome namun evolusi tersebut tidak merubah sequence asam amino protein. Ini menunjukkan bahwa protein GAG-CA dan ENV-TM berperan penting baik dalam interaksi dengan sel inang maupun dalam patogenesis.
2) Uji pendahuluan ekspresi (pilot expression) protein rekombinan GAG-CA dan ENV-TM dalam E.colL. Uji pendahuluan ekspresi protein rekombinan dilaksanakan pada vektor ekspresi pG EX-CA dan pGEX-TM untuk menghasilkan masing-masing protein rekombinan GAG-CA dan ENV-TM. Ekspresi protein dilaksanakan dalam E.coli BL 21. Maka sebeiumnya kedua plasmid tersebut diisolasikan dari bakteri rekombinan E.coli DH 5a kemudian ditransfeksikan dalam E. coli BL 21. Bakteri E. coli BL 21 dianjurkan untuk ekspresi protein dari konstruksi dalam pGEX-2 T, namun konstruksi tidak stabil dalam bakteri ini. Maka dipergunakan E. coli DH 5a sebagai sock plasmid. Berbagai kondisi du-uji cob a, ialah konsentrasi IPTG (induktor), saat induksi (pada kultur dengan OD 600nm 0,6, 1,5 atau kultur semalam dan lama waktu induksi. Hasil menunjukkan bahwa kondisi optimal ekspresi protein adalah induksi dengan ImM IPTG, saat induksi pada kultur bakteri dengan OD 600nm mencapai 0,6 dan lama induksi 2 sampai 4 jam. Untuk konstruksi pGEX-CA didapatkan protein tambahan berberat molekul 48 kDa dibanding dengan kultur kontrol (bakteri tanpa plasmid). Berat molekul ini sesuai dengan berat molekul protein GAG-CA yang difusikan dengan GST. Dalam kondisi yang dipergunakan, tidak ada atau sedikit ekspresi protein ENV-TM berfusi dengan GST.
Program tahun ke-Ill ditunjukkan untuk memproduksi secara besar-besaran protein rekombinan GAG-CA berfusi dengan GST dengan kolom affinitas serta pemotongannya dari GST dengan thrombin, memproduksi secara besar-besaran calon vaksin DNA yaitu pcDNA-CA dan pcDNA-TM menggunakan Endofree column, uji coba vaksin DNA secara invitro.
|
|---|